液相色谱法检测罐装食品中类雌激素双酚A和烷基酚

液相色谱法检测罐装食品中类雌激素双酚A和烷基酚

　　近年来，环境内分泌干扰物对生态环境的不良影响已引起人们广泛的关注。其中壬基酚(nonylphenol，NP)、辛基酚(octylphenol，OP)和双酚A(bisphenol A，BPA)已在众多的体外试验和体内实验中被证实对动物具有潜在的雌激素效应。随着工业化的发展，壬基酚、辛基酚和双酚A的广泛使用，可以通过食物或生物链进入动物和人体内，对人类健康构成较大的威胁，最终危害人体健康。因此，建立一套科学检测壬基酚、辛基酚和双酚A的方法，正确评估壬基酚、辛基酚和双酚A危险性十分必要。

　　国内外的分析工作者针对OP、NP、BPA的检测研究了许多方法，使用最广泛的检测技术是色谱法，主要是气相色谱法、气相色谱.质谱联用技术 刮液相色谱法 、液一质谱联用技术5-7，本研究用液液萃取、固相萃取(SPE)等前处理方法，结合高压液相色谱法(HPLC)一荧光检测手段，建立检测食品中NP、OP和BPA的方法。

　　材料与方法

　　一、实验材料

　　1.仪器：分析天平(SARTURIUS公司，美国)，超声波清洗器(Elma公司，德国)，氮吹仪(EYELA公司，美国)，液相色谱仪(LC7000，济南海能仪器)。所有玻璃器皿、用具采用重铬酸钾洗液浸泡3—8 h再经超纯水清洗，或经过400 cc高温烘烤4 h处理，以避免过程中引入干扰。

　　2.试剂和标准品：双酚A(纯度>99.0% ，东京化成工业株式会社)，壬基酚(纯度>99.0% ，东京化成工业株式会社)，辛基酚(纯度>99.0% ，Ehrenstorfer GmbH公司，德国)，甲醇(色谱纯，Fisher公司)，二氯甲烷(色谱纯，Fisher公司)，丙酮(色谱纯，Fisher公司)，盐酸(优级纯，北京化工厂)，乙醚(优级纯，北京化工厂)，氢氧化钠(分析纯，北京化工二厂)，NH，固相萃取(SPE)柱(Waters公司，美国)。

　　双酚A标准储备液的制备：准确称取10 mg双酚A标准品，溶于甲醇中并定容至10 ml，保存于冰箱4 cc中备用。壬基酚标准储备液的制备：准确称取10 mg壬基酚标准品，溶于甲醇中并定容至10ml，保存于冰箱4 cc中备用。辛基酚标准储备液的制备：准确称取10 mg辛基酚标准品，溶于甲醇中并定容至10 ml，保存于冰箱4 cc中备用。壬基酚、辛基酚、双酚A混合标准使用液：精密吸取上述壬基酚、辛基酚、双酚A标准贮备液，用甲醇配制使壬基酚、辛基酚、双酚A含鞋分别为1ug/L、1ug/L、1ug/L的混合标准使用液，保存于冰箱4度中备用。

　　二、实验方法

　　1.样品处理：(1)液液萃取：取样品10 g，加入硅藻土30 g，用甲醇25 ml超声提取30 min，提取3次，过滤，取滤液蒸发溶剂至近于，用20 ml氢氧化钠(1 mol/L)溶解，过滤，滤液转移至50 m1分液漏斗中。滤液用12 mol/L HC1酸化至pH=2～3，加10 ml二氯甲烷振荡萃取，分出有机层，重复萃取3次，合并有机层。过无水硫酸钠后，于40 qC旋转蒸发仪上浓缩至近干，上柱。(2)SPE萃取：将上述残渣用二氯甲烷溶解，加入到处理好的NH柱[用10 ml甲醇一丙酮(50：50)，5 ml正己烷淋洗活化的NH 柱]用5 ml正己烷淋洗NH 柱，真空泵将SPE柱残留的液体抽去，接下来用10 ml甲醇一丙酮(50：50)洗脱。将洗脱液用氮气吹干，然后用甲醇定容到1 ml，用于HPLC分析。

　　2.液相色谱参考条件：(1)色谱柱：C18(3.5 um，2.1×150 mm)。(2)柱温：25 cc。(3)荧光检测器的激发波长：225 nm;发射波长：310 nm。(4)流动相为甲醇和水：梯度洗脱程序：55%甲醇7 min内线性增加到70%甲醇，再于1 min内线性增加到80% 甲醇，保持30 min，然后在1 min内线性降低到55%甲醇，保持11 min，等待进样。(5)流速0.15 ml/min。

　　3.测定：在相同的液相色谱条件下，分别将标准溶液和样品溶液注入液相色谱仪中，以保留时间定性，以试样峰面积与标准比较定量。

　　结 果

　　方法学参数

　　1.线性范围：精密吸取壬基酚、辛基酚、双酚A混合标准使用液，加甲醇配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0ug/L不同浓度的BPA、NP、OP的标准混合溶液，各进样10 l，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积值为纵坐标，含量为横坐标绘制标准曲线，BPA、NP和OP的相关系数(R )分别为0.9998、0.9985和0.9988;回归方程分别为】，=723X一1.83×10 、Y=1060X一1.27×10 和】，=1710X一2.73×10’。在0.1～0.2 g/L范围内具有良好线性关系。

　　2.检出限和定量限：采用峰高计算噪音水平和分析物信号，以信噪比3的浓度作为检测限(LOD)，结果蔬菜类罐装食品和方便面BPA、NP和OP的检出限为0.5、0.1和0.1ug/kg，鱼、肉类罐装食品BPA、NP和OP的检出限为1、0.5和0.5ug/kg。

　　3.准确度：蔬菜类罐装食品和方便面BPA、NP和OP的检出限为0.5、0.1和0.1 g/kg，鱼、肉类罐装食品BPA、NP和OP的检出限为l、0.5和0.5 g/kg。BPA、NP和OP加标回收率分别为74.9% ～95.1% 、76.3% ～103.6% 和72.1% ～109.2% ;相对标准偏差(RSD)分别为4.98% ～1 1.2% 、2.35% ～8.88% 和5.61% ～12.3% 。采集不同种类罐装食品，进行BPA、NP、OP的加标试验。按10 g样品分别加入l0、50和100 ng3个水平的标准溶液，分析方法如实验部分中所述(n=5)。实验结果如下：蔬菜罐头食品BPA、NP、OP的加标回收率分别为81.2% ～90.2%、85.1% ～91.2% 、80.2% ～85.5% ，相对标准偏差分别为5.6l% ～8.19% 、2.35% ～5.55% 、5.61% ～8.61%;方便面食品BPA、NP、OP的加标回收率分别为83.5% ～95.1% 、89.6% ～95.4% 、80.6% ～84.6% ，相对标准偏差分别为4.98% ～8.79% 、3.11% ～6.22% 、6.38% ～9.05% ;鱼罐头食品BPA、NP、OP的加标回收率分别为74.9% ～80.1% 、80.1% ～103.6% 、75.5% ～102.1% ，相对标准偏差分别为6.22% ～ 11.2% 、6.54% 一8.88% 、10.2% ～12.3%;肉类罐头食品BPA、NP、OP的加标回收率分别为78。1% ～ 81.3% 、76.3% ～ 86.1% 、72.1% ～109.2% ，相对标准偏差分别为9.55 D/c～10.5% 、7.12% ～ 8.56% 、9.98% ～ 11.5% 。BPA 、NP和OP回收率均符合欧盟指令2001/22/EC对加标回收率的要求(70% ～110%)。图1为标准混合物、试样及其加标回收的典型色谱图。

　　图1 标准混合物、试样及其加标回收的典型色谱图

　　4.精密度：取试样照上述测定方法，重复测定5次，BPA、NP和OP的相对标准偏差(RSD)分别为7.9% ～16.2% 、9.8% ～12.6% 和3.0% ～17.5% ，均满足痕量分析对精密度的要求。

　　二、试样含量测定

　　对市售的鱼、蔬菜、肉类罐装食品及方便面按上述方法进行处理，精密吸取试样溶液，按上述色谱参数和条件，每个试样平行测定2次，取平均值。按校正曲线法计算各试样中的含量，测定结果见表1。

　　讨 论

　　提取条件的优化

　　1.提取溶液的选择：实验中比较了正己烷、乙醚、二氯甲烷、甲醇等溶剂的超声提取效果，结果表明甲醇、二氯甲烷提取效果较好，但二氯甲烷毒性较大，故采用甲醇提取。由于烷基酚是具有酚羟基的化合物，显弱酸性，可溶于碱性溶液中。笔者将烷基酚(BPA、OP、NP)溶于氢氧化钠溶液中，用盐酸(pH：3)酸化，使烷基酚(BPA、OP、NP)游离，用二氯甲烷萃取。实验中比较了正己烷、乙醚、二氯甲烷等溶剂的萃取效果，这些萃取溶液对待测物质的回收率分别为正己烷71.2% ～80.5% ，乙醚75.6% ～85.8% 、二氯甲烷85.5% ～104.9% ，结果表明二氯甲烷的萃取率最高，因此选用二氯甲烷作为萃取剂。

　　2.实验比较了在pH=3、pH=5条件下的萃取率，结果表明，在pH=3的条件下萃取率较高，故选萃取pH值为3。

　　2.SPE萃取方法的优化(固相萃取柱及洗脱剂的选择)：由于食品样品基质比较复杂，虽然经过上述液液萃取净化，但仍有杂质干扰，需进一步进行SPE萃取净化。上述液液萃取是采用二氯甲烷作为萃取剂，所以考虑使用正相萃取柱。据文献报道 J，N柱、NH 柱和硅胶柱对样品的净化和对待测物质的保留的研究情况表明，CN柱除了对BPA有较高的回收率外，对NP、OP和4-n—NP的保留都相对较差;而硅胶柱去除脂肪的效果较差;NH，柱除了具有较好的去除脂肪效果外，对待测物质的回收率也十分理想，因此本实验选择了NH 柱作为固相萃取柱，而且获得了较好的回收率。将清洗液通过之前用10 ml甲醇一丙酮(50：50)淋洗，5 ml正己烷活化的NH：柱，之后再用5 ml正己烷淋洗NH 柱，再用1O ml甲醇一丙酮(50：50)洗脱。正己烷可除去极性小的脂肪、油脂成分。NP和OP的极性较低，BPA的极性相对较高。单纯使用甲醇或丙酮无法洗脱目标化合物，当甲醇一丙酮(50：50)溶液洗脱SPE柱，所得结果最理想。

　　二、色谱条件的优化

　　1.色谱柱的选择：目前采用液相色谱方法对BPA、OP和4-NP分析时，基本采用反相色谱，流动相以甲醇一水、乙腈一水体系为主，适当调节酸度，调节酸度所用的酸主要是乙酸或使用缓冲盐溶液。本实验分别考察了不同色谱柱c c 和苯基柱对BPA、OP和4一NP的分离效果，结果表明，使用c。(载体粒度为5 m)、C 和苯基柱时，BPA基线分离，峰形对称，OP、NP分离效果不好。使用WatersXTerra@ MS C】8(载体粒度为3.5 m)时，BPA、OP、NP基线分离，峰形对称，分离效果较好。此外，本实验研究表明若在流动相中加入乙酸、三乙胺等调节pH值，OP、NP峰形变胖，分离效果并不理想。

　　2.流动相的选择：本实验采用Waters XTerraⅢMS C18液相色谱柱分离，考察不同比例甲醇一水、乙腈一水作为流动相梯度洗脱的效果。结果表明，甲醇一水作为流动相的分离效果明显好于乙腈一水作为流动相的分离效果。当以甲醇一水作为流动相，梯度洗脱时，分离效果较好。

　　3.柱温的选择：比较柱温为25、3O、4O℃ 时对OP、4-NP和BPA分离和色谱峰形，结果表明，温度升高，保留时间减小，分离效果和色谱峰形无明显改变，故选择25℃作为检测温度。

　　4.其他影响因素：由于SPE柱容量较小，柱长较短，因此为了保证较高的洗脱能力，甲醇、水淋洗和乙醚洗脱时，应将流出的速度控制在2～3 ml/min，而不能采用抽真空的方式，否则洗脱效果较差，需要增加洗脱剂的用量。

　　此方案建立了罐装食品中类雌激素(NP、OP和BPA)的HPLC一荧光测定方法。方法的准确度和精密度满足痕量分析的要求，该方法具有简便、快速的优点。