液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量

液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量

　　醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮为合成的孕激素类药物，有明显的孕激素和抗雄激素作用，可抑制排卵。孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作用，动物实验表明有死胎率增加和致畸作用，副作用有：(1)恶心、头晕、倦怠;(2)突破性出血;(3)孕期服用，会增加女性后代的男性化作用。孕激素类药物能增强体内物质沉积和改善生产性能，可以很快产生显著和直接的经济效益，因此，对生产者有很大的吸引力。畜牧业中使用孕激素类药物(非治疗用途)已有很长的历史，但人类长期食用含有激素的肉制食品，即使含量甚微，亦会明显影响机体的激素平衡，而且有致癌危险，对幼儿造成发育异常等危害。因此，开发一种能检测孕酮残留量的方法是十分必要的。本文采用高效液相色谱法对牛和猪脂肪样品中的孕酮进行检测.

　　1　试剂与仪器

　　1.1　试剂　醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品，乙腈，甲醇，乙酸乙酯，其他试剂为分析纯。水由净化系统制得。

　　(1)标准储备液：1000μg/ml，分别准确称取0.05g 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品于50ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。

　　(2)混合中间溶液I：100μg/ml，分别吸取10.0ml 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准储备液于100ml 容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。

　　(3)混合中间溶液II：1.0μg/ml，取1.00ml 混合中间溶液I于100ml 容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用半年。

　　(4)混合标准工作液：分别吸取10、20、40、80、100μl 混合中间溶液II 添加到980、970、950、910、890μl 的乙腈-水(65：35)中，再加入10μl 0.2%盐酸溶液，混匀，得到浓度为0.010μg/ml、0.020μg/ml、0.040μg/ml、0.080μg/ml 和0.10μg/ml 混合标准工作液，供液相色谱测定，当日使用。

　　1.2　仪器　LC7000 液相色谱系统，LC7011泵体，LC7020 紫外-可见检测器，Hanon-Clarity色谱软件。氮吹仪;海能全自动固相萃取装置;低温离心机;涡旋混匀器;CN 固相萃取柱。

　　2　测定步骤

　　2.1　试样的制备与保存

　　2.1.1　试样的制备　把大约5g 的猪或牛脂肪组织切成小块，然后放入底部塞有玻璃棉的漏斗中，放入150ml 的烧杯中，将烧杯置于微波炉内。根据所熬制脂肪量，使用最大功率，加热30 ～60s，如果脂肪没有融化，可在间隔30 ～60s 以后重复加热30 ～60s，直到有液体脂肪流出，通过漏斗滴入烧杯中。把熬制好的脂肪油放入样品瓶中，密封，并做上标记。

　　2.1.2　样品的保存　把熬制好的脂肪油样品置于-18℃中，冷冻保存.

　　2.2　提取　称取熬制好的脂肪油2.00 ±0.01g，置于50ml具塞离心管中，加入5ml 乙腈，于60℃水浴中保温3min 以使固体脂肪溶化，涡旋振摇1min，在-5℃下离心7min(离心力1160g)，吸取上清液至15ml 带塞聚丙烯离心管，再在沉淀物中加入5ml 乙腈重复提取一次，合并上清液。在合并的乙腈提取液中加入2 ×2ml 正己烷，涡旋振摇1min，于-5℃中离心5min(离心力1160g)，弃去正己烷层。乙腈提取液于60℃中用氮吹仪吹干，残渣待皂化。

　　2.3　皂化　在残渣(2.2 项)中依次加入4ml 正己烷、1ml0.1mol/L 氢氧化钠溶液和0.5ml 1.0mol/L 氯化镁溶液，于涡旋混匀器上快速混匀10s，在60℃水浴中保温15min，于-5℃中离心5min(离心力1160g)，吸取上清液至15ml玻璃试管。在沉淀物中再加入4ml 正己烷混匀后，在60℃水浴中加热15min 后， 在-5℃ 中离心5min (离心力1160g)，合并上清液。于60℃中用氮气吹干仪吹干，用1.0ml 正己烷溶解残渣，待净化。

　　2.4　净化　将皂化后的样液(2.3 项)倒入经5ml 乙酸乙酯和6ml 正己烷预处理过的CN 柱中，用2 ×1ml 正己烷润洗玻璃试管，洗液倒入到CN 柱中。待样液流过后，依次用5ml 正己烷和6ml 5%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗柱子，随后打开真空泵将小柱中液体抽干，保持抽气2min。最后用3.5ml 20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱，洗脱液收集于15ml 玻璃试管中，于60℃中用氮气吹干仪吹干。残余物用990μl 乙腈-水(65：35) 涡旋溶解，静止15min 后，加入

　　10μl 0.2%盐酸溶液，混匀，供液相色谱测定。

　　2.5　测定

　　2.5.1　液相色谱条件　色谱柱：C18 柱(250mm ×4.6mm，5μm);预柱：C18 柱(12.5mm ×4.6mm，5μm);流动相：乙腈-水(65：35);流速：1畅0ml/min;柱温：35℃;检测波长：292nm;进样量：40μl。

　　2.5.2　液相色谱测定　根据样液中3 种孕酮的含量情况，选定浓度相近的标准工作液，标准工作液和样液中3 种孕酮的响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准工作液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，标准品的色谱图见图1。

　　图1　醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的色谱图(100 ng/ml)

　　1 -醋酸甲地孕酮，2 -醋酸氯地孕酮，3 -醋酸美仑孕酮

　　3　结果与讨论

　　3.1　线性范围　醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮浓度在0.010 ～0.10μg/ml 范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，其相关系数(γ2 )均大于0.998。

　　3.2　回收率、精密度和定量检测限　本实验以2 种脂肪(牛脂肪和猪脂肪)作为样本。取适量标准品加入到2.0g样品中，使添加量相当于10、20 和50μg/kg，每个添加水平各取24 份试样(每种脂肪各12 份)。图2 为空白脂肪样品和添加样品(10μg/kg)的色谱图。表1 为醋酸美仑孕酮，醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮外标法测得的室内回收率和精确度。表2 为8 家实验室的室间回收率和精确度结果。根据回收率试验，能可靠测得的最低浓度确定定量检测限(LOQ)，LOQ 为10μg/kg，满足残留限量的检测要求。

　　(A)

　　(B)

　　(C)

　　(D)

　　图2　空白脂肪样品和添加样品(10(g/kg)的色谱图

　　A：牛脂肪空白样;B：猪脂肪空白样;C：牛脂肪添加样;D：猪脂肪添加样