多肽反相HPLC分离中色谱柱的作用

多肽反相HPLC分离中色谱柱的作用

HPLC色谱柱为多肽吸附提供疏水性的表面。色谱柱由不锈钢管构成,内部填充微径、球形的吸附微粒，微粒通常采用硅胶，硅胶微粒的表面已经用硅烷试剂反应过以使其疏水。合成聚合物(比如聚苯乙烯- 二乙烯基苯)也可以用作多肽的HPLC吸附剂。

吸附剂的孔径

HPLC吸附剂是多孔微粒，用于反应的表面大部分位于小孔中。因此，多肽分子必须进入孔中才能被吸附和分离。

HPLC曾多年使用孔径约100Å的微粒。这种多肽色谱法很差，部分是因为许多多肽分子太大而无法进入这种直径的孔中。Grace Vydac为HPLC改进的大孔径(～300 Å)球形硅胶微粒宣告了用RP-HPLC有效分离多肽的开始。今天，虽然有些肽(<～2000 MW)也能用100 Å孔径的微粒分离，但大多数多肽都是用孔径约300 Å的微粒填充色谱柱来完成分离的。

吸附剂粒度

色谱柱中吸附剂的粒度影响洗脱峰宽，小直径的微粒通常产生更尖的峰和更高的分离度。

毛细分析和少量制备分离推荐使用5微米材料(色谱柱内径10mm)。直径大一点的实验室色谱柱通常装填10µm的材料。内径大于22mm的过程色谱柱通常装填15 µm或更大的微粒，其粒度分配也比用于分析型色谱柱的宽(见40-42页)。

吸附相种类

通过氯硅烷把疏水相键合到硅胶基质上就形成了反相HPLC吸附剂，这些硅胶基质分子上有一个能附着疏水基团的活性氯基。

形成疏水相的烃基通常是十八碳(C18)、八碳(C8)或四碳(C4)的线性脂肪族烃。烃链的长度在蛋白质分离效果上一般没有什么不同。分离给定大小和疏水性的多肽时哪种固定相可能最有效有规可循，参见图7中的总结。对于肽和少于5000道尔顿的小分子蛋白质最好选用C18色谱柱。最小的分子和最亲水的肽通常在小孔的C18柱子上分离得最好。大于5000道尔顿的蛋白质或小分子多肽非常疏水，最好选用C4色谱柱。C8柱与C18色谱柱的应用差不多，但分离个别肽时有时表现出不同的选择性和分离能力。苯基柱没有C4柱子那么疏水，所以对有些多肽表现出独特的选择性。

反相表面的细微差别有时会造成RP-HPLC对多肽选择性的不同，可以利用这一点来优化特定肽的分离。

如图8所示，肽分离的选择性可能受疏水表面性质的影响。图中所示的五种肽的选择性在C18和C4色谱柱上几乎一样，虽然在C4柱子中的保留时间短。苯基柱与C18柱相比，保留时间短，选择性也不同。缓激肽含有两个苯丙氨酸，与其它肽相比，其在苯基柱上的保留时间比在C18柱上稍长。

图8. 肽在不同反相色谱柱上的分离。 色谱柱：VYDAC 218TP54 (C18); 214TP54 (C4); 219TP54(苯基) 洗脱液：15-30%ACN+0.1%TFA，1.0mL/min，30min 样品：1.催产素， 2.缓激肽， 3.血管紧张素II， 4.神经紧张素， 5. 血管紧张素I

血管紧张素I含有一个组胺酸，血管紧张素II含有两个组胺酸。在苯基柱子上，这两者都比其它肽洗脱得早。分离肽时(比如蛋白质消化物中的肽)，最好试用不同的疏水相，以选出针对特定肽混合物具有最佳选择性的相来。肽的RP-HPLC分离基于肽和反相表面之间的微妙作用。 反相表面的微小变化能影响肽的分离，虽然小但很重要。有些肽的分离对键合在硅胶基质上的疏水相的密度和均匀度非常敏感(图9)。

图9.低碳装填C18RP-HPLC色谱柱(B)分离在标准碳装填色谱柱(A)上只有部分分离的两种肽。色谱柱：A. VYDAC 218TP52-标准C18,5μm,2.1x250mm B. VYDAC 218LTP52低碳负载C18，5μm,2.1x250mm 洗脱液：6 mM TFA/4mM HFBA，11-95%ACN,0.25mL/min,75min 样品：Asp-N蛋白质消解物。

不同的反相吸附剂在分离蛋白质酶消化物中的肽碎片时可能表现出不同的选择性。用两种RP-HPLC色谱柱分离β-乳球蛋白A的胰蛋白酶消化物碎片，结果表明：不同的相有时对肽的反相分离具有微小的影响(图10)。与通常使用的C18色谱柱相比，C4柱的保留时间稍短，肽碎片洗脱图形也有某些程度上的不同。测试不同的色谱柱是确定哪个柱子分离度最好的唯一实用的方法。有些实验室利用反相色谱柱的选择性差异来进行肽的二维分离。

图10. 色谱柱：VYDAC 218TP54 (C18);214TP54 (C4);洗脱液：0-30%ACN+0.1%TFA水溶液，1.0 mL/min，60min。 样品：β-乳球蛋白A的胰蛋白酶消化液。

什么是聚合物键合?它又是怎样影响肽的选择性的?反相HPLC吸附剂一般通过把含有一个活性氯的氯硅烷烃键合到硅胶基质上制成。这些就形成了所谓的单体键合相，它在硅胶基质上有一个附着点。也可以用具有多个活性氯的氯硅烷烃，这就是所谓的聚合物键合相，单个氯硅烷烃在相中交联并在硅胶基质上面形成硅氧烷聚合物，同时附着多个疏水链。虽然单体键合相与聚合物键合相的疏水性和分离特性相似，但在分离肽时，尤其是蛋白质的酶消化物中的肽时，它们会具有不同的选择性。这种不同的选择性为色谱工作人员优化蛋白质消化物和其它肽的选择性和分离度提供了更多的选择空间。图11给出了用单体键合吸附剂和聚合物键合吸附剂分离一系列合成多肽的例子。这些肽分离选择性的明显差异已经标出，但同时也提供了进行肽分离时对色谱柱的另一种选择。

图11.色谱柱：聚合物键合色谱柱VYDAC 218TP54与238TP54单体键合色谱柱(C18,5μm,4.6x250mm) 洗脱液：10-40%ACN+0.1%TFA，30min。 流速：1.0 mL/min。

合成聚合物吸附剂的作用

虽然硅胶HPLC色谱柱在酸性pH和周围温度的温和条件下表现良好，但在极端条件(高pH、高温)下，硅胶色谱柱的效果就会降低。合成聚合物(比如比如聚苯乙烯- 二乙烯基苯)能为多肽分离提供机械强度高的基质。

硅胶色谱柱在中度pH与温度的操作环境下表现良好，但有时也会需要在比常规pH、温度高或在高浓度的离液剂(比如盐酸胍)中操作的需要。聚苯乙烯- 二乙烯基苯等机械强度高的合成聚合基质在苛刻的条件下比较稳定，可以作为实用的硅胶替代品。图12表示的是用合成聚苯乙烯- 二乙烯基苯色谱柱对几种多肽的分离。其性能和硅胶色谱柱相似，这样就使在相对苛刻的条件下用合成聚合基质进行多肽分离成为可能。

图12.合成聚合物色谱柱(聚苯乙烯-二乙烯基苯)对肽的分离。 色谱柱：VYDAC 259VHP5415 (PS-DVB, 5μm,4.6x150mm) 洗脱液：15–30% ACN+0.1% TFA，15min。 流速：1.0mL/min 肽：1.催产素 2.缓激肽 3.神经紧张素 4. 神经紧张素1–8 5.血管紧张素III 6. val-4血管紧张素III

用合成聚合物制成的分离材料的一个优点是，它们在pH极值时不分解。这样，在色谱后能使用强酸或强碱溶液作为清洗剂把蛋白质或其它物质从色谱柱上洗下来，见图13，在这个例子中，基于聚苯乙烯- 二乙烯基苯的色谱柱可以用强碱(1N氢氧化钠)和强酸(1N硫酸)进行清洗。清洗前、用强酸清洗后和用强碱清洗后肽的色谱分析都产生相似的峰形、保留时间和分离度，这证明用强试剂清洗柱子并不会对色谱柱的性能产生负面影响。

图13.用强试剂清洗前(A)、用1N NaOH清洗后(B)、用1N硫酸清洗后(C)，合成聚合物(聚苯乙烯-二乙烯基苯)色谱柱对肽的分离情况。 色谱柱：VYDAC 259VHP5415 (PS-DVB, 5μm,4.6x150mm) 洗脱液：15–30%ACN+ 0.1%TFA，15min 流速：1.0 mL/min 肽：1.催产素 2.缓激肽 3. 血管紧张素III 4. 章鱼素 5.神经紧张素

色谱柱尺寸：柱长

影响蛋白质分离的吸附/脱附几乎全部发生在色谱柱的顶端。因此，柱长并不显著影响蛋白质的分离和分离度。于是，常用5-15cm的短柱分离蛋白质。蛋白酶消化物中的小分子肽用长柱子分离较好，15-25cm长的色谱柱常用于合成肽、天然肽与酶消化标记物的分离。例如，Stone和Williams发现：与用150mm柱(80个峰)和50mm柱(65个峰)相比，用250mm柱子(104个峰)能 从羧甲基转铁蛋白的胰蛋白酶消化物中分离出更多的肽碎片。

柱长对分离的其他方面也有影响。

样品容量

样品容量是色谱柱体积的函数。对等直径的柱子而言，柱子越长样品容量越大。

柱压

柱压与柱长成正比。当用异丙醇等粘性更大的溶剂时，较短的柱子会产生较低的柱压。

柱子尺寸：直径

柱子直径不影响峰分离，但影响进样、溶剂使用和检测灵敏度。随着HPLC柱子直径的减小，流速相应降低，由此，溶剂的使用量减少，检测灵敏度提高。液质(LC/MS)联用时，直径非常小的HPLC柱子尤其有用。

分析1-200微克多肽样品的分析柱标准直径是4.6mm。较大直径的色谱柱用于大量多肽的纯化(见40-48页制备分离)。近年来，小直径柱子(0.075mm到2.1mm)的使用有所增加，因为小直径柱子有以下优点：

减少溶剂用量

用于毛细色谱柱和小孔色谱柱的流速为每分钟几微升(见50页附录A)。低流速能显著减少多肽分离所需的溶剂量。

增加检测灵敏度

低流速的小孔色谱柱洗脱多肽所需的溶剂体积较少。检测器反应随着流速的降低而增强。流速200mL/min的窄径柱的灵敏度是流速1.0mL/min分析型色谱柱的六倍。

能处理小量样品

检测灵敏度增加意味着能检测小量样品。用窄径RP-HPLC柱能分离和收集5纳摩尔的胰蛋白酶消化产物。

与质谱接口

小孔色谱柱可以直接将HPLC洗脱液转移到质谱接口中，用精密的MS仪器可对阿摩尔(10-18)级的单个样品进行常规检测。(见28-31页LC/MS)。

小直径色谱柱的当今趋势

窄径柱

内径2.1mm的微孔柱流速为100-300mL/min。对于大多数想减少溶剂用量、提高检测灵敏度的实验室来说，微孔柱是一个实用的措施。大部分标准HPLC系统都能在这些低流速下运行，而很少需要或不需要修改。200mL/min左右的微孔柱与空气辅助质谱有很好的接口。

微孔柱和毛细柱

虽然使用直径1.0mm或更小的色谱柱，溶剂用量明显减少、检测灵敏度也有所提高，但是，它们的HPLC系统需要修改，或用于该目的的特制仪器。

进行数据流分割后，毛细色谱柱能与电喷雾甚至纳升电喷雾质谱仪接口。

Davis和Lee的在一篇论文中提供了用微孔柱和毛细管柱取得最佳性能的有价值的信息，值得使用小孔色谱柱的人阅读。很多期刊都有关于质谱与毛细管柱联用的详细论文(见26-29页)。

例子

微孔柱。图14表示的是用微孔柱(内径1.0mm)对血红素的胰蛋白酶消化物的分离。

图14. 用微孔RP-HPLC色谱柱对血红素的胰蛋白酶消化物的分离(参考文献26)。 色谱柱：C18, 1.0x250mm(VYDAC 218TP51)。 流速：50 μL/min 洗脱液：0-40%梯度的B，50min，溶剂A为0.1% TFA水溶液，溶剂B为0.1% TFA乙腈溶液。

毛细管柱。图15所示的是用内径75µm的毛细管柱对肌球素的胰蛋白酶消化物分离的例子。

图15. 毛细RP-HPLC色谱柱对肌球素的胰蛋白酶消化物的分离。 色谱柱：C18 (VYDAC 218MS), 内径75μm，毛细管柱 流速：0.5 μL/min 洗脱液：水/TFA/乙腈的梯度洗脱。

毛细管柱进样量。图16表示的是用内径300µm的毛细管柱对3皮摩尔BSA的胰蛋白酶消化物的分离，采用质谱检测。

图16.用内径300µm的毛细RP-HPLC色谱柱对BSA的胰蛋白酶消化物的分离。 样品：3皮摩尔 色谱柱：VYDAC 218MS5.305 5μm, 300 A, 聚合物-C18反相柱(300μm 内径x 50mm柱长). 流速：5 μL/min. 流动相: A = 0.1%甲酸，98%水,2% CAN;B = 0.1% 甲酸, 98% ACN, 2%水。 梯度：3%B保持0-5分钟，然后从3%B渐变到65min时的50%B，最终70min时渐变到75%B。 检测器：质谱(MS)。 (a)总离子数。(b)基峰强度。 基峰是指色谱图中每次振幅最大时的单个质谱峰。基峰的色谱图强调了含有单个主要分子的峰，消除了异常峰和噪声。