高效液相色谱法测定化学合成生物多肽

高效液相色谱法测定化学合成生物多肽

多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。80年代中期至今多肽化学合成技术有很大发展，合成的成品一般是以目标多肽为主的几种结构相似多肽的混合物，对多肽混合物的分离分析及纯度鉴定一直是一个重要问题。本文主要介绍本人在分析多肽类化合物过程中的一些心得和经验.

首先，在色谱柱选择方面，因为多肽的分子量较大(一般在几千到几万)，分子量在10000左右的，常用的C18柱分离效果不太好，要选用碳链比较短的色谱柱，如：C8或者C4;填料孔径不能选普通的100埃，要选孔径比较大的如300埃等。分子量在几万或者几十万的，可以选体积排阻色谱，用凝胶色谱柱。

其次，在用反相色谱柱时，因为多肽是由氨基酸组成的，流动相选择一般用含0.1%的三氟乙酸水和含0.1%的三氟乙酸乙腈的梯度洗脱。但因为多肽类化合物的紫外吸收较弱，检测波长一般选在200~210nm左右，所以空白梯度的基线会往上漂移很多，特别是样品浓度比较小的时候，分析误差较大。考虑乙腈的本底吸收比水大，在梯度洗脱过程中，随着乙腈比例的增大，基线会向上漂。因此把乙腈中的三氟乙酸浓度降为0.05%~0.07%(可以随梯度不同选不同浓度)，通过两者紫外吸收的抵消，基线变得平稳很多，同时能增加检测的灵敏度，使分析更灵敏、更准确。

第三，合成的多肽中的杂质一般与产物结构相似，极性相差无几，分离难度较大，在选择洗脱梯度时要细心一点，多做一些试验，最好要做主峰的纯度扫描，尽量把杂质完全分开，对于难分离的多肽，可以选长一点的色谱柱或者延长梯度洗脱的时间。

还有最后一招，如果按以上方法分离还是不太好的话，可以适当的提高柱温，我们有一品种就是这样的，当柱温升到60度时，塔板数和与杂质的分离度都能得到一定的改善。

HPLC 分析柱有两类：离子交换柱和反相柱。离子交换 HPLC 依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用，柱子在一定 PH 范围带有特定电荷衍变成一种离子体，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸组成表现出相反电荷，分离是一种电荷相互作用，通过改变 PH 值、 离子强度，达到分离纯化的效果。通常，先用低离子强度的溶液，以后逐渐加强或一步一步加强，直到多肽从柱中洗脱出。

反相 HPLC 条件与正常层析正相反，多肽通过疏水作用连到柱上，用降低离子强度洗脱， 如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成，这种链长度为 G4-G8 碳原子。 由于洗脱是一种疏水作用。长链柱比短链对小的，高带电肽好;另一方面大的疏水肽用短链柱洗脱好。

典型的操作常由两绶冲剂组成， 0.1%TFA-H2O 和 80% acetonitrile 0.1%TFA--H2O 稀 acetonitrile 。用线型梯变以每分钟 0.5% 到 1.0% 改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为 4.6× 250mm (3-10μ m) 和 22× 250mm (10μ m). 如果用径向填柱，那么大小是 8×100 ( 3-10μ m )和 25× 250mm (10μ m)

大量各种缓冲剂含许多不同试剂，比如 heptafluorobutyric 酸， 0.1% 磷酸， 稀 Heformic 酸 (5-6%, pH2-4), 10 -100mM NH4HCO3, 醋酸钠 / 氨， TFA/TEA ，磷酸钠或钾，异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂，但要注意一点：硅反相柱料不能长时间暴露于高 pH ，甚至微碱 pH ， 因为这样会破坏柱子

一般多肽分离拿150mm的柱子就可以了，250mm在分离度上改善不大，因为多肽的分离机理和小分子不同。

小分子是通过液液交换，所以柱子越长交换越充分，分离度也越高。

多肽在柱子上的保留和分离其实主要发生在柱头，也就是说，多肽先在柱头都被保留下来，随着梯度上升逐渐被洗脱，所以柱长对多肽分离的影响比起其对小分子的分离度影响小得多。