烟草含氮化合物测定

烟草含氮化合物测定

　　第一节 烟叶中氮化合物的特性及其测定意义

　　1烟草中氮素形态：

　　蛋白质 氨基酸 酰胺 NH3 硝酸盐 植物碱 未知氮化物

　　2烟草氮化合物分类：

　　1) 水不溶性氮：部分蛋白质(醇溶性和脂溶性蛋白质)

　　2) 水溶性氮：除去不溶性蛋白质，剩余氮化物都是水溶性的，其中也包括了水溶性蛋白质。蛋白质占整个含氮化合物的60%-90%，植物体中蛋白质的含氮量为15%-17.6%，平均为16%(蛋白质系数)烟草样品(干烟叶)中主要的含氮化合物是蛋白质(8%)和生物碱(1.5-3.5%)，其次是游离氨基酸(0.8%)等。

　　3含氮化合物测定意义

　　含氮量高的鲜烟叶，其多酚氧化酶活性也高，烘烤时易出现黑糟烟

　　含氮化合物高的干烟叶，燃吸时，味苦，辛辣，刺激性强，杂气大。

　　第二节 烟叶总氮测定

　　烟叶中总氮含量高，则其它氮化物含量往往也高，蛋白质和烟碱也高，因此测定总氮的含量对了解烟叶氮化物的特征具有代表性。

　　一、测定方法

　　测定主要有凯氏法和杜马法两种。

　　杜马法就是将烟叶燃烧，收集N2和其它氮的氧化物，所用仪器十分精密。现在主要用的是凯氏法。

　　二、凯氏法定氮

　　原理：烟草中的含氮化合物用浓硫酸消煮分解，使其中各种形态的氮素全部转化为氨，并与硫酸结合形成硫酸铵，然后加碱(NaOH)蒸馏，使硫酸铵中的NH3释放出来，用硼酸吸收，然后用标准酸(H2SO4)滴定，计算出N含量。

　　1、烟样消化

　　在高温下浓硫酸是一种强氧化剂，能将有机物中的碳全部分解氧化成CO2,从而破坏了有机物的结构，样品中的含氮化合物，如蛋白质，在浓硫酸的作用下，水解为氨基酸，氨基酸脱氨产生NH3,NH3与硫酸结合成为硫酸铵留在溶液中。

　　2、蒸馏

　　向消化液中加入过量的强碱NaOH，使(NH4)2SO4的NH3逸出，并用硼酸溶液吸收之。

　　3、滴定

　　用标准酸滴定硼酸吸收的氨，根据标准酸的用量计算出消化液中的N量。

　　这种测定总氮的方法最初是由凯德尔(Kjeldahl)1884年在研究蛋白质中的N时发明的，所以叫凯氏定氮法。该种方法测定结果准确可靠，但是

　　(1)消化时间过长，浓硫酸(沸点360℃)在360℃下加热分解烟样需5h以上。

　　(2)标准液配制麻烦。原始的凯氏定氮法中，需要配制两种标准溶液(H2SO4和NaOH)。因为最初是用H2SO4吸收蒸馏出来的NH3,然后用NaOH滴定多余的H2SO4。

　　2凯氏法的改进

　　缩短消化时间

　　A 加入增温剂K2SO4或Na2SO4 K2SO4可以提高消化液的沸点，加速有机物质分解。K2SO4可以将消化液的沸点升高到400℃以上，但是一般应控制在360-400℃之间，如果加入K2SO4量过多，则会使沸点温度超过400℃，使生成的硫酸铵也会被分解释放出氨。一般每毫升硫酸加入0.5K2SO4即可。Na2SO4的作用与K2SO4相同，但效果稍差。

　　B 加入催化剂CuSO4 起催化作用的试剂还有有Hg HgO Se FeSO4 NiSO4 从催化效率看硒>汞>铜，但是汞和硒都有毒，不常使用。CuSO4是目前广泛使用的催化剂。

　　催化剂和增温剂混合同时使用效果更好，CuSO4 ：K2SO4=1：10

　　C 加入氧化剂 H2O2 HClO4 K2CrO7 氧化剂主要是提高消化液中的氧气，使供氧充足，大大缩短了消化时间。HClO4和 K2CrO7作氧化剂，可以将消化时间缩短到30-60min，但是K2CrO7会引入K离子，不能一液多用测定烟样中的K含量。HClO4不稳定。

　　1) 蒸馏方法改进

　　a改全部蒸馏为部分蒸馏

　　b承接流出液由硫酸改为硼酸

　　NH3和硼酸没有起化学反应，而是吸附在硼酸分子上。

　　2) 滴定方法改进

　　由用标准NaOH滴定H2SO4,改为用H2SO4滴定硼酸吸附的NH3。

　　3) 消化工具改进

　　改进前：凯氏瓶 电炉

　　改进后：消化管 红外线消煮炉

　　每批可以作40个样品。

　　改进后形成了许多不同的方法，主要以消化时所加的试剂不同命名：

　　1. H2SO4-H2O2法 稳定，N不损失，2-3h

　　2. H2SO4-K2SO4法 稳定，时间长，不可测K

　　3. H2SO4-K2SO4-CuSO4法稳定，时间长，不可测K

　　4. H2SO4-HClO4法 时间短，不稳定，N易损失

　　5. H2SO4-K2CrO4法 时间短不稳定N易损失 不测K

　　三、H2SO4-H2O2消化法测烟草总氮

　　1原理 用强氧化剂高温消煮烟草样品，将其中的有机物质氧化成CO2,各种形态的氮素全部转化为氨，并与硫酸结合形成硫酸铵，然后用碱(NaOH)蒸馏，使硫酸铵中的NH3释放出来，并用硼酸吸收，最后用标准酸(H2SO4)滴定硼酸吸附的NH3，并计算出样品N含量。

　　2步骤

　　1) 消化

　　0.2g样品于消化管中，加6mL浓硫酸，放置过夜(也可直接消化)―――于消煮炉上先低温慢加热至开始冒出大量白烟，待白烟减少时，取出稍冷却，逐滴加入30%H2O2 10D，充分振荡―――继续放于消煮炉上加热，再冒白烟，再沸腾，待白烟再减少时，取出稍冷却，逐滴加入30%H2O2 8D 充分振荡―――再继续消煮，每次待白烟减少时滴加的H2O2量都比前次减少2D，直至最后溶液澄清无色。最后一次滴加H2O2后应继续加热沸腾5-10min，以除尽H2O2。

　　在消煮的同时作2份空白试验：可以用葡萄糖代替烟样，也可以不用葡萄糖，直接将6mL浓硫酸进行消化。

　　消化液冷却，加水稀释后定容100mL

　　消化液颜色变化：黑色――酱油色――红宗色――黄色―――无色

　　2) 蒸馏

　　从100mL待测液中取10mL于半微量凯氏定氮整流器中，加5mL40%NaOH溶液蒸馏。流出液用加有2D溴钾酚绿-甲基红指示剂的2%硼酸5mL吸收。指示剂颜色变化：红紫色――兰紫色

　　3) 滴定

　　用已知浓度的标准酸0.01mol/LH2SO4滴定流出液中被硼酸吸附的NH3, 溶液颜色变化：兰紫色――微红色，根据标准酸的用量计算出烟叶总氮含量。

　　四、扩散皿法测烟叶总氮

　　1原理同消煮法

　　2待测液制备同消煮法

　　3用扩散法代替蒸馏法将待测液中硫酸铵中的NH3扩散进入硼酸溶液中，然后用标准酸滴定硼酸溶液中吸附的NH3。

　　扩散皿的内室(低)装入2mL硼酸溶液，外室(高)加入1mL待测液盖上毛玻璃，边缘涂上碱性甘油密封后，从小空向外室注入1mL 40%NaOH溶液，立即密封。在25-30℃扩散24h。扩散温度不易超过30℃，否则扩散皿会破裂。

　　第三节、烟草中蛋白质测定

　　一、间接法 ：通过测定样品中蛋白质的含氮量来推算蛋白质的含量的方法。

　　1间接计算法

　　粗蛋白质%=(总N%-烟碱%*0.1728)*6.25

　　2间接测定法

　　1) 原理：先把蛋白质从烟样中分离出来，然后对含蛋白质的沉淀进行消化，蒸馏和滴定，测出蛋白质中总氮含量，然后根据蛋白质系数6.25换算出蛋白质含量。

　　2)步骤

　　2g样品于烧杯中，加入50mL沸水，6%CuSO4 和NaOH各25mL――加热搅拌15min，放置1h――过滤，蛋白质形成的沉淀留在残渣中，虑液中是水溶性氮化物。这就将蛋白质和水溶性氮化物分开了――取下带虑渣的漏斗60℃稍烘干―――滤纸带残渣一并放入消煮管内消化，蒸馏，滴定，测定出蛋白质含氮量，并计算出蛋白质的量。

　　蛋白质%=蛋白质N%*6.25

　　二、直接法：根据蛋白质的理化性质如，对紫外光的吸收，双缩尿反应等测定蛋白质的含量。

　　鲜组织中蛋白质的测定最常用的是考马斯亮蓝法，该法用牛血清蛋白作工作曲线牛血清蛋白需在低温冰箱中保存。

　　第四节水溶性总氮的测定

　　烟叶总的氮化物包括：1可溶性氮2不可溶性氮

　　间接测定法测定蛋白质时，将烟叶总的氮化物分为两部分：

　　1蛋白质

　　2除去蛋白质外的水溶性氮化物

　　水溶性总氮包括::氨态氮，酰胺态氮，氨基态氮

　　因此将除去蛋白质的水溶液消化后,按照凯氏法测定其中的氮含量,就是水溶性总氮.

　　(一)酰胺态氮的测定

　　1、原理：酰胺化合物在酸性或碱性条件下都易于分解产生NH3

　　(二)自由态氮的测定

　　原理：自由态氮易挥发，如果在强碱介质中蒸馏，其他形式的氮也被蒸馏出来，因此在缓冲溶液中并且低温低压条件下，直接蒸馏水溶性氮待测液，测出的就是自由氨中的氮。

　　与酰胺氮测定的区别：免去3M硫酸水解，及加NaOH中和

　　(三)总植物碱氮的测定

　　烟草中主要的植物碱：

　　烟碱，降烟碱，新烟草碱，假木贼碱

　　总植物碱氮近似=烟碱×0.1728

　　(四)未知来源的氮测定

　　烟草可溶性氮化合物包括：自由氨，酰胺，烟碱，胺和其他形式未知态氮化合物。用强碱蒸馏可溶性氮液，可以将各种形式的氮化合物都蒸馏出来，除植物碱外，都是以NH3-N的形式被承接(盐酸)吸收的。以铵盐存在。铵盐可以和纳氏试剂显色，在一定范围内颜色深浅和铵盐量成正比。

　　未知N%=比色测得N%-自由态氨N%-酰胺态N%