高效液相色谱法应用现状与展望

高效液相色谱法应用现状与展望

　　摘要 本文概述了高效液相色谱(HPLC)的系统组成、分类、工作原理及特点，并展望了高效液相色谱法的应用与发展前景。

　　关键词 流动相;液相色谱;色谱柱

　　Applications and prospects of high performance

　　liquid chromatography

　　1Wang Jun

　　(School of Chemstry and Chemcial Engeering,Guizhou University, Guiyang,550025)

　　Abstract This article provides an overview of the high performance liquid chromatography (HPLC) system, classification, working principles and characteristics, and looks forward to the prospect of the application and development of high-performance liquid chromatography.

　　Keywords mobile phase; liquid chromatography; column

　　引言

　　高效液相色谱分析(HPLC)是以高压液体为流动相的液相色谱分析法，是 20世纪60年代末发展起来的一项新颖快速的分离分析色谱技术。它是在经典的液体柱色谱法的基础上，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，引入气相色谱理论后发展起来的。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号或进行数据处理而得到分析结果。HPLC 几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝大多数物质成分的分离分析。

　　1.高效液相色谱法概述

　　1.1仪器结构与原理[1]

　　HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。

　　其基本原理是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号或进行数据处理而得到分析结果。其基本组成如下图所示：

　　1.2高效液相色谱分析的分类[2]

　　高效液相色谱法按分离机制的不同分为液-固吸附色谱法、液-液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法、体积排阻色谱法以及亲和色谱法。

　　(1) 液-固吸附色谱法：使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上的分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度为5 µm～10 µm。适用于分离分子量为200～1000 的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

　　(2) 液-液分配色谱法：使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。

　　(3) 离子交换色谱法：固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面末端芳环上接上羧基、磺酸基(称阳离子交换树脂) 或季氨基( 阴离子交换树脂)。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

　　(4) 离子对色谱法：又称偶离子色谱法，是液-液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。

　　(5) 体积排阻色谱法：固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长;大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

　　(6) 亲和色谱法：将在不同基体上键合多种不同特性的配位体作为固定相，具有不同pH 的缓冲溶液作流动相，依据生物大分子(氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等)与基体上键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别，而实现对具有生物活性的生物分子的分离。

　　2.高效液相色谱法应用现状

　　高效液相色谱分析(HPLC )几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝大多数物质成分的分离分析。

　　祁彦、占春瑞等[3]运用高效液相色谱法测定了大豆中13种三嗪类除草剂多残留量。建立了同时检测大豆中13种三嗪类除草剂多残留量的反相高效液相色谱(RP- HPLC )方法。样品经乙腈提取，凝胶渗透色谱和中性氧化铝SPE柱净化，然后采用RP- HPLC二极管阵列检测法测定，外标法定量。方法简便、快速，净化效果较好，可同时满足进、出口大豆中多种除草剂残留量的检验工作需要。

　　董雪玲、刘大锰等[4]运用高效液相色谱法测定大气颗粒物中的杂环胺，建立了大气颗粒物中杂环胺的高效液相色谱稔测方法。采用ODSC协色谱柱(250mm×4.6mm，5um)，乙腈~0.01mol/L三乙胺缓冲溶液液(pH4.0)为流动相，实现了6种杂环胺的基线分离和4种杂环胺的高灵敏度荧光检测。

　　樊苑牧、俞雪钧等[5]运用高效液相色谱法测定含脂羊毛中灭蝇胺和环虫腈。建立了高效液相色谱法(HPLC)测定含脂羊毛中的灭蝇胺和环虫腈的方法及HPLC-MS/MS确证方法。取得了良好的效果。

　　吴燕华、刘文力等[6] 运用高效液相色谱法测定苹果中的酚类物质。利用高效液相色谱法分析了红星、秦冠、小国光、黄元帅和富士5个苹果品种果皮和果肉中小分子酚类物质的分布情况。色谱柱为C18柱，流动相为甲醇和水，在此色谱条件下，各组分均得到良好分离。

　　谢 莹、杭太俊等[7] 运用高效液相色谱法测定中药中齐墩果酸和熊果酸含量。建立多种中药中熊果酸与齐墩果酸含量测定方法，并确证两种成分的存在形式，得出了可同时测定熊果酸与齐墩果酸含量，可用于药材质量控制的结论。

　　郑 屹、陈赛慧等[8] 运用高效液相色谱法检测细胞能量代谢物质。建立了高效液相色谱法(HPLC)测定细胞中ATP、ADP和AMP含量的方法，以比较高糖培养的MRC-5细胞和D-半乳糖诱导的拟衰老MRC-5细胞能量代谢水平。结果表明高效液相色谱法可检测出不同状态细胞能量物质的差异，其具有操作简便、快速、重现性好等特点，可以作为线粒体能量代谢功能的评估方法之一。

　　刘俊、吉晓佳等[9] 运用高效液相色谱法检测植物组织中多胺含量。对反相高效液相色谱技术测定苯甲酰化多胺的方法进行了探讨，确定和研究了苯甲酰化反应的最佳温度、时间和影响苯甲酰化多胺稳定性的因素，优化了多胺的色谱分析条件。

　　曹淑瑞、刘治勇等[10]运用高效液相色谱法同时测定了食品中6种对羟基苯甲酸酯。建立了同时检测食品中6种对羟基苯甲酸酯的高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)定量分析方法。样品用乙腈提取，经LC-C18固相萃取柱净化，采用AgilentC18色谱柱分离，甲醇/水溶液梯度洗脱，二极管阵列检测器检测，外标法定量。实验效果良好。

　　3.高压液相色谱的优势和不足

　　液相色谱法最大的特点是可以分离不可挥发或受热后不稳定的有机物，而且比气相色谱流动相的选择余地大。由于HPLC 的具有色谱柱可以反复使用，流动相可选择范围宽，流出组分容易收集，分离效率高，分析速度快，灵敏度高，操作自动化，适用范围广( 样品不需气化，只需制成溶液即可)，定量分析方法的准确度高的特点，在《中国药典》中该法已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。它与气相色谱法配合使用，几乎可以承担绝大部分的有机物分离测试任务。高效液相色谱法总结起来有“四高一广”的特点：

　　(1)高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

　　(2)高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。

　　(3)高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

　　(4)高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng,进样量在μL数量级。

　　(5)应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

　　高压液相色谱不足之处是定性能力较差。

　　4.应用前景展望

　　由于高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。 与试样预处理技术相配合，HPL C 所达到的高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能，能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展，有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。 HPL C可以成为解决生化分析问题最有前途的方法。HPL C具有的高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用，流出组分易收集等优点，因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。液相色谱-质谱连用技术受到普遍重视，如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等; 液相色谱-红外光谱连用也发展很快，如在环境污染分析测定水中的烃类、海水中的不挥发烃类，使环境污染分析得到新的发展。