土壤全氮量的测定

土壤全氮量的测定

　　1、方法概述

　　测定土壤全氮量的方法主要可分为干烧法和湿烧法两类。

　　干烧法是杜马斯(Dumas)于1831年创立的，又称为杜氏法。其基本过程是把样品放在燃烧管中，以600℃以上的高温与氧化铜一起燃烧，燃烧时通以净化的CO2气，燃烧过程中产生的氧化亚氮(主要是N2O)气体通过灼热的铜还原为氮气(N2)，产生的CO则通过氧化铜转化为CO2，使N2和CO2的混合气体通过浓的氢氧化钾溶液，以除去CO2，然后在氮素计中测定氮气体积。

　　杜氏法不仅费时，而且操作复杂，需要专门的仪器，但是一般认为与湿烧法比较，干烧法测定的氮较为完全。

　　湿烧法就是常用的开氏法。这个方法是丹麦人开道尔(J.Kjeldahl)于1883年用于研究蛋白质变化的,后来被用来测定各种形态的有机氮.由于设备比较简单易得,结果可靠,为一般实验室所采用.此方法的主要原理是用浓硫酸消煮,借催化剂和增温剂等加速有机质的分解,并使有机氮转化为氨进入溶液,最后用标准酸滴定蒸馏出的氨。

　　此方法进行了许多改进，一是用更有效的加速剂缩短消化时间;二是改进了氨的蒸馏和测定方法，以提高测定效率。

　　在开氏法中，通常都用加速剂来加速消煮过程。加速剂的成分按其效用的不同，可分为增温剂、催化剂和氧化剂等三类。

　　常用的增温剂主要是硫酸钾和硫酸钠。在消煮过程中温度起着重要作用。消煮时的温度要求控制在360～410℃之间，低于360℃，消化不容易完全，特别是杂环氮化合物不易分解，使结果偏低，高于410℃则容易引起氨的损失。温度的高低受加入硫酸钾的量所控制，如果加入的硫酸钾较少(每毫克硫酸加硫酸钾0.3g)，则需要较长时间才能消化完全。如果加入的硫酸钾较多，则消化时间可以大大缩短，但是当盐的质量浓度超过0.8g·mL-1时，则消化完毕后，内容物冷却结块，给操作带来一些困难。因此，消煮过程中盐的浓度应控制在0.35～0.45g·mL-1,在消煮过程中如果硫酸消耗过多，则将影响盐的浓度，一般在开氏瓶口插入一小漏斗，以减少硫酸的损失。

　　开氏法中应用的催化剂种类很多。事实上多年来人们致力于开氏法的改进，多数集中在催化剂的研究上。目前应用的催化剂主要有Hg、HgO、CuSO4、FeSO4、Se、TiO2等，其中以CuSO4和Se混合使用最普遍。

　　Hg和Se的催化能力都很强，但在测定过程中，Se会带来一些操作上的困难。因为HgO能与铵结合生成汞—铵复合物。这些包含在复合物中的铵，加碱蒸馏不出来，因此，在蒸馏之前，必须加硫代硫酸钠将汞沉淀出来。

　　HgO+(NH4)2SO4=[Hg(NH3)2]SO4+H2O

　　[Hg(NH3)2]SO4+Na2S2O3+ H2O=HgS+Na2SO4+(NH4)2SO4

　　产生的黑色沉淀(HgS)会使蒸馏器不易保持清洁，且汞有毒，污染环境，因此在开氏法中，人们不喜欢用汞作催化剂。

　　硒的催化作用最强，但必须注意，用硒粉作催化剂时，开氏瓶中溶液刚刚清澈并不表示所有的氮均已转化为铵。由于硒也有毒性，国际标准(ISO11261：1995)改用氧化钛(TiO2)代替硒，其加速剂的组成和比例为K2 SO4:Cu SO4·5H2O:TiO2=100:3:3。

　　近年来氧化剂的使用特别是高氯酸又引起人们的重视。因为HClO4—H2SO4的消煮液可以同时测定氮、磷等多种元素，有利于自动化装置的使用。但是，由于氧化剂的作用过于激烈，容易造成氮的损失，使测定结果很不稳定，所以，它不是测定全氮的可靠方法。

　　目前在土壤全氮测定中，一般认为标准的开氏法为：称1.0～10.0g土样(常用量)，加混合加速剂K2SO410g，CuSO41.0g，Se0.1g，再加浓硫酸30mL，消煮5h。为了缩短消煮时间和节省试剂，自20世纪60年代至今广泛采用半微量开氏法(0.2～1.0g土样)。

　　开氏法测定的土壤全氮并不完全包括NO3-—N和NO2—N，由于它们含量一般都比较低，对土壤全氮量的测定影响也小，因此可以忽略。但是，如果土壤中含有显著数量的NO3-—N和NO2—N，则须用改进的开氏法。

　　消煮液中的氮以铵的形态存在，可以用蒸馏滴定法、扩散法或比色法等测定。最常用的是蒸馏滴定法，即加碱蒸馏，使氨释放出来，用硼酸溶液吸收，而后用标准酸滴定之。蒸馏设备用半微量蒸馏器，对于半微量蒸馏器，近年来也有不少研究和改进，现在除了用电炉加热和蒸汽加热各种单套半微量蒸馏器外，还有多套半微量蒸馏器联合装置，即一个蒸汽发生器可同时带四套定氮装置，既省电，又提高了功效，颇受科研工作者的欢迎。

　　扩散法是用扩散皿(即Conway皿)进行的。皿分为内外两定(如图4-1)，外室盛有消化液，内室盛硼酸溶液，加碱液于外室后，立即密封，使氨扩散到内室被硼酸溶液吸收，最后用标准酸滴定之。有人认为扩散法的准确度和精密度大致和蒸馏法相似，但扩散法设备简单，试剂用量少，操作简单，时间短，适于大批样品的分析。

　　比色法适用于自动装置，但自动比色分析应有一个比较灵活的显色反应。县在显色反应中不应有沉淀、过滤等步骤。氨的比色分析，以靛酚蓝比色法最灵敏，干扰也较少。连续流动分析(CFA)中铵的分析采用靛酚蓝比色法。

　　土壤氮的测定是重要的常规测试项目之一。因此，许多国家都致力于研制氮素测定的自动、半自动分析仪。目前国内外已有不少型号的定氮仪。

　　利用干烧法原理研制的自动定氮仪，有的可进行许多样品的连续燃烧，使各样品的氮全部还原成氮气，彻底清除废气后，使氮气进入精确的注射管，自动测定其容(μL)，例如Cole-man29-29A氮素自动分析仪以及德国的N-A型快速定氮仪;有的则不清除CO2，而同时将N2和CO2送入热导池探测器，利用N2和CO2的导热系数不同，而同时测定N2和CO2(例如Leco Corporation, CR-412, CHN600, CHN1000型等)。

　　利用湿烧法的自动定氮仪，实际上是开氏法的组装，所用试剂药品也同开氏法。它可同时进行多个样品消煮，它的蒸馏、滴定及结果的计算等步骤均系自动快速进行。分析结果能同时数字显示并打印出来。

　　2、土壤全氮测定 ---半微量开氏法

　　2.1方法原理

　　样品在加速剂的参与下，用浓硫酸消煮时，各种含氮有机物，经过复杂的高温分解反应，转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以标准酸溶液滴定，求出土壤全氮量(不包括全部硝态氮)。

　　包括硝态和亚硝态氮的全氮测定，在样品消煮前，需先用高锰酸钾将样品中的亚硝态氮氧化为硝态氮后，再用还原铁粉使全部硝态氮还原，转化成铵态氮。

　　在高温下硫酸是一种强氧化剂，能氧化有机化合物中的碳，生成CO2，从而分解有机质。

　　2H2SO4+C→2H2O+2SO2↑+ CO2↑高温

　　样品中的含氮有机化合物，如蛋白质在浓H2SO4的作用下，水解成为氨基酸，氨基酸又在H2SO4的脱氨作用下，还原成氨，氨与H2SO4结合成为硫酸铵留在溶液中。

　　Se的催化过程如下：

　　2H2SO4+Se→H2SeO3+2SO2↑+ H2O

　　亚硒酸

　　H2SeO3→SeO2+H2O

　　SeO2+C→Se+CO2

　　由于Se的催化效能高，一般常量法Se粉用量不超过0.1～0.2g，如用量过多则将引起氮的损失。

　　(NH4)2SO4+H2SeO3→(NH4)2 SeO3+H2SO4

　　3(NH4)2 SeO3→2NH3+3Se+9H2O+2N2↑

　　以Se作催化剂的消煮液，也不能用于氮磷联合测定。硒是一种有毒元素，在消化过程中，放出H2Se。H2Se的毒性较H2S更大，易引起人中毒。所以，实验室要有良好的通风设备，方可使用这种催化剂。

　　Δ

　　4CuSO4+3C+2H2SO4→2Cu2SO4+4SO2↑+3CO2↑+2H2O

　　Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+ SO2↑

　　褐红色 蓝绿色

　　当土壤中有机质分解完毕，碳质被氧化后，消煮液则呈现清澈的蓝绿色即“清亮”，因此硫酸铜不仅起催化作用，也起指示作用。同时应该注意开氏法刚刚清亮并不表示所有的氮均已转化为铵，有机杂环态氮还未完全转化为铵态氮，因此消煮液清亮后仍需消煮一段时间，这个过程叫“后煮”。

　　消煮液中硫酸铵加碱蒸馏，使氨逸出，以硼酸吸收之，然后用标准酸液滴定之。

　　蒸馏过程的反应：

　　(NH4)2SO4+2NaOH→Na2SO4+2NH3+2H2O

　　NH3+H2O→NH4OH

　　NH4OH+H3BO3→NH4·H2BO3+H2O

　　滴定过程的反应：

　　2NH4·H2BO3+ H2SO4→(NH4)2SO4+ H2O

　　2.2主要仪器

　　消煮炉、半微量定氮蒸馏装置(图4-2)、半微量滴定管(5mL)。

　　2.3试剂

　　(1)硫酸。 ρ=1.84g·mL-1，化学纯;

　　(2)10mol·L-1NaOH溶液。 称取工业用固体NaOH420g，于硬质玻璃烧杯中，加蒸馏400mL溶解，不断搅拌，以防止烧杯底角固结，冷却后倒入塑料试剂瓶，加塞，防止吸收空气中的CO2，放置几天待Na2CO3沉降后，将清液虹吸入盛有约160mL无CO2的水中，并以去CO2的蒸馏水定容1L加盖橡皮塞。

　　(3)甲基红—溴甲酚绿混合指示剂。0.5g溴甲酚绿和0.1g甲基红溶于100mL乙醇中(注1)。

　　(4)20g·L-1 H2BO3—指示剂。20g H2BO3(化学纯)溶于1L水中，每升H2BO3溶液中加入甲基红—溴甲酚绿混合指示剂5mL并用稀酸或稀碱调节至微紫红色，此时该溶液的pH为4.8。指示剂用前与硼酸混合，此试剂宜现配，不宜久放。

　　(5)混合加速剂。K2SO4:CuSO4:Se=100:10:1即100g K2SO4(化学纯)、10g CuSO4 ·5H2O(化学纯)、和1g Se粉混合研磨，通过80号筛充分混匀(注意戴口罩)，贮于具塞瓶中。消煮时每毫升H2SO4加0.37g混合加速剂。

　　(6)0.02 mol·L-1(1/2 H2SO4)标准溶液。量取H2SO4(化学纯、无氮、ρ=1.84g·mL-1)2.83mL，加水稀释至5000mL，然后用标准碱或硼砂标定之。

　　(7)0.01 mol·L-1(1/2 H2SO4)标准液。将0.02 mol·L-1(1/2 H2SO4)标准溶液用水准确稀释一倍。

　　(8)高锰酸钾溶液。25g高锰酸钾(分析纯)溶于500mL无离子水，贮于棕色瓶中。

　　(9)1:1硫酸(化学纯、无氮、ρ=1.84g·mL-1)。硫酸与等体积水混合。

　　(10)还原铁粉。磨细通过孔径0.15mm(100号)筛。

　　(11)辛醇。

　　2.4测定步骤

　　(1)称取风干土样(通过孔径0.149mm筛)1.0000g[含氮约1mg(注2)]，同时测定土样水分含量。

　　(2)土样消煮

　　①不包括硝态氮和亚硝态氮的消煮：将土样送入干燥的开氏瓶(或消煮管)底部，加少量无离子水(0.5～1mL)湿润土样后(注3)，加入加速剂2g和浓硫酸5mL，摇匀，将开氏瓶倾斜置于300W变温电炉上，用小火加热，待瓶内反应缓和时(10～15min)，加强火力使消煮的土液保持微沸，加热的部位不超过瓶中的液面，以防瓶壁温度过高而使铵盐受热分解，导致氮素损失。消煮的温度以硫酸蒸气在瓶颈上部1/3处冷凝回流为宜。待消煮液和土粒全部变为灰白稍带绿色后，再继续消煮1h。消煮完毕，冷却，待蒸馏。在消煮土样的同时，做两份空白测定，除不加土样外，其他操作皆与测定土样相同。

　　②包括硝态氮和亚硝态氮的消煮：将土样送入干燥的开氏瓶(或消煮管)底部，加高锰酸钾溶液1mL，摇动开氏瓶，缓缓加入1:1硫酸2 mL，不断转动开氏瓶，然后放置5min，再加入1滴辛醇。通过长颈漏斗将0.5g(±0.01g)还原铁粉送入开氏瓶底部，瓶口盖上小漏斗，转动开氏瓶，使铁粉与酸接触，待剧烈反应停止时(约5min)，将开氏瓶置于电炉上缓缓加热45min(瓶内土液应保持微沸，以不引起大量水分丢失为宜)。停火，待开氏瓶冷却后，通过长颈漏斗加加速剂2g和浓硫酸5mL，摇匀。按上述①的步骤，消煮至土液全部变为黄绿色，再继续消煮1h。消煮完毕，冷却，待蒸馏。在消煮土样的同时，做两份空白测定。

　　(3)氨的蒸馏

　　①蒸馏前先检查蒸馏装置是否漏气，并通过水的馏出液将管道洗净。

　　②待消煮液冷却后，用少量无离子水将消煮液定量地全部转入蒸馏器内，并用水洗涤开氏瓶4～5次(总用水量不超过30～35mL)。若用半自动式自动定氮仪，不需要转移，可直接将消煮管放入定氮仪中蒸馏。

　　于150mL锥形瓶中，加入2020H2BO3—指示剂混合液5mL(注4)，放在冷凝管末端，管口置于硼酸液面以上3～4cm处(注5)。然后向蒸馏室内缓缓加入10 mol·L-1NaOH溶液20 mL，通入蒸汽蒸馏，待馏出液体积约50mL时，即蒸馏完毕。用少量已调节至pH 4.5的水洗涤冷凝管的末端。

　　③用滴定馏出液由蓝绿色至刚变为红色。记录所用酸标准溶液的体积(mL)。空白测定所用酸标准溶液的体积，一般不得超过0.4mL。

　　2.5结果计算

　　土壤全氮(N)量(g·kg-1)=

　　式中：V——滴定试液时所用酸标准溶液的体积(mL);

　　V0——滴定空白时所用酸标准溶液的体积(mL);

　　c——0.01 mol·L-1(1/2 H2SO4)或HCl标准溶液浓度;

　　14.0——氮原子的摩尔质量(g·mol-1);

　　10-3——将mL换算为L;

　　m——烘干土样的质量(g)。

　　两次平行测定结果允许绝对相差：土壤全氮量大于1.0 g·kg-1时，不得超过0.005%;含氮1.0～0.6 g·kg-1时，不得超过0.004%;含氮<0.6 g·kg-1时，不得超过0.003%。

　　注释：

　　注1.对于微量氮的滴定还可以用另一更灵敏的混合指示，即0.099g溴甲酚绿和0.066g甲基红溶于100mL乙醇中。如要配制成20g·L-1 H2BO3—指示剂溶液：称取硼酸(分析纯)20g溶于约950mL水中，加热搅动直至H2BO3溶解，冷却后，加入混合指示剂20mL混匀，并用稀酸或稀碱调节至紫红色(pH约5)，加水稀释至1L混匀备用。宜现配。

　　注2.一般应使样品中含氮量为1.0～2.0mg，如果土壤含氮量在2 g·kg-1以下，应称土样1g;含氮量在2.0～4.0 g·kg-1者，应称土样0.5～1.0g;含氮量在4.0g·kg-1以上，应称土样0.5g。

　　注3.开氏法测定全氮样品必须磨细通过100孔筛，以使有机质能充分被氧化分解，对于粘质土壤样品，在消煮前须先加水湿润使土粒和有机质分散，以提高氮的测定效果。但对于砂质土壤样品，用水湿润与否并没有显著差别。

　　注4.硼酸的浓度和用量以能满足吸收NH3为宜，大致可按每亳升10g·L-1 H2BO3能吸收氮(N)量为0.46mg计算，例如20 g·L-1 H2BO3溶液5mL最多可吸收的氮(N)量为5×2×0.46=4.6mg。因此，可根据消煮液中含氮量估计硼酸的用量，适当多加。

　　注5.在半微量蒸馏中，冷凝管口不必插入硼酸液中，这样可防止倒吸减少洗涤手续。但在常量蒸馏中，由于含氮量较高，冷凝管须插入硼酸溶液，以免损失。