微波消解‐ICPMS测定动物血清和组织器官中的微量银元素

微波消解‐ICPMS测定动物血清和组织器官中的微量银元素

摘要

银的应用在当代生物医学领域得到极大地推广，其生物安全性也受到密关注，明确银离子在生物体内分布以及其安全阈值显得格外重要。因此，需要一种高灵敏度的分析方法来确定医学生物样品中银的含量。电感耦合等离子体质谱(ICP‐MS)法对于金属离子检测具有很高的灵敏度，非常适用于医学生物样

品中所含痕量银元素的检测，但具体方法的开发，包括样品前处理和检测过程，尚处于起步阶段。本研究建立了一套简便易行的微波消解处理机体血清和组织器官样品，通过ICP‐MS 法测定样品内微量银元素的检测方法。检测结果表明ICP‐MS 方法可以准确地测定机体的微量银元素，所建立的方法适用性强，可满足不同类型医学生物样品中微量银元素的测定，操作简便快捷，结果准确且灵敏度高，尤其适合于大批量生物样品的检测，为其他生物样品微量元素的检测提供了指导。

关键词

微波消解;ICP‐MS ;血清;组织;器官;银

引　言

银被公认具有广谱抗菌活性，从古希腊人用银来处理溃疡促进伤口的愈合，到现代银在纺织、化妆品、水质消毒剂、伤口辅料和医疗器械等方面应用获得极大地推广。由于目前公开发表的动物实验和人体接触银流行病学研究存在局

限性，银对人体毒性反应没有被明确，其生物安全性方面和人体吸收银离子的潜在组织器官危害引起了热议 ，明确银在机体内分布显得尤为重要。

微量元素检测常用的方法有原子吸收分光光度法(火焰与石墨炉) 、原子荧光法、极谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法等。其中电感耦合等离子体质谱(ICP‐MS)法具有灵敏度高、消耗样品量少、检测速度快、检出限低、线性范围宽、能同时测定多种元素的优点，已越来越多地被应用于生物样品分析中 。ICP‐MS 由离子源和质谱仪两个主要部分构成，样品经消解成溶液后，样品溶液经过雾化器由载气送入ICP 炬焰中，经过蒸发、解离、原子化、电离等过程，转化为带正电荷的离子，经离子采集系统进入质谱仪，质谱仪根据质荷比进行分离，对于一定质荷比，质谱积分面积与进入质谱仪的离子数成正比，即样品中元素浓度与质谱的积分成正比，并与标准系列比较定量。

目前，国内外对于医学生物样品经处理后采用ICP‐MS检测其中的银元素的具体方法尚处于起步阶段，本研究应用可降解含银生物陶瓷修复兔股骨髁缺损，术后定期采集样本，在总结前人工作的基础上 ，详细研究了ICP‐MS 法

　　测定动物血清和组织器官中的银含量时样品的前处理和检测方法，该法简便易行、快速准确、灵敏度高，尤其适合于大批量医学生物样品的检测，对不同类样品银元素测定和同类样品中其他元素的测定具有一定的指导意义。

1 　实验部分

1.1 　仪器和试剂

ICP‐MS ，配有自动进样器

微波消解仪

硝酸(69% ，质量浓度)

过氧化氢(30% ，质量浓度)

内标原液(Y ) ：10mg · L - 1

银标准贮备液：

超纯水

高纯氦气(纯度≥ 99.999% ) ;

液氩(纯度≥ 99.999% ) 。

1.2 　样品采集及处理

兔死后采集心脏、肝脏、脾脏和肾脏器官，以及内植物周围骨、肌肉和骨髓组织，以β‐磷酸三钙植入组为空白对照。所有器皿及消化罐均须先以20% (φ)硝酸浸泡24 h ，然后用水反复冲洗，最后用超纯水冲洗干净。将样品从冰箱取出，充分解冻。根据样品性状，血清样品称取1.0 g(精确至0.001 g) ，动物组织及器官样品称取0.5 ～ 1.0 g(精确至0.001 g) 。将样品置于聚四氟乙烯消化罐中，加入5 mL 纯硝酸浸泡1 h ，再加入2 mL H2 O2 ，盖上密封盖，放入微波消解仪中，微波消解仪功率和加热时间调至

最佳程序(见表1) ，消解结束后，将聚四氟乙烯消解罐置于赶酸仪上，调节赶酸温度至140 ℃ ，将酸液赶至0.5 mL 时停止赶酸，冷却至室温，加入2 mL 5% (φ)硝酸润洗消解罐内壁后，将消解液转移至10 或25 mL 容量瓶中，用超纯水冲洗消化罐内壁3 次以上，合并至容量瓶中，用2% (φ)硝酸定容至刻度，混匀，待测。同时做试剂空白试验。

1.3 　标准曲线制备

首先制备银标准中间液(1.0 mg · L - 1 ) ，即吸取银标准贮备液5.00 mL 于500 mL 容量瓶中，用5% (φ)硝酸溶液定容至刻度，此溶液每升含1 毫克银。用移液枪移取银标准中间液按表2 配制标准曲线溶液，使用时限为2 个星期，以2% (φ)稀硝酸为基体溶液。

1.4 　ICP‐MS 仪器工作参数

1.4.1 　质谱调谐优化

使用含1 μg · L - 1 Be ，Mg ，In ，Ce ，U质谱调谐液优化仪器工作条件，使仪器灵敏度、氧化物、双电荷、背景等各项指标符合测定要求，仪器优化调谐参数见

1.5.2 　仪器参数和测定方法

将不同浓度的标准曲线溶液分别进行测定，以内标溶液在线混合进样，记录标准溶液与内标溶液离子数比值，以它为纵坐标Y ，标准溶液浓度为横坐标X ，绘制标准工作曲线，将样品消解溶液注入电感耦合等离子体‐质谱仪中，得到相应的信号响应值，根据标准曲线得到待测溶液中银元素的浓度，平行测定次数为5 次。质谱分析方法见表4 ，设定参数见表5 。

2 　结果与讨论

2.1 　微波消解处理样品

在采样和制备过程中应注意不使样品受到污染。HNO3 ‐H2 O2 能发生连锁反应，增强硝酸的消解能力，能更彻底地破坏有机物，消解效果更佳。5 mL HNO3 和2 mL H2 O2 消解体系硝酸用量少，最终获得的样品消解溶液澄清透明;消解程序采用2000W 功率3 步式温度梯度，样品消解完全，获

得的数据重复性好，且耗费时间短，为大批量样品处理节省了时间。

2.2 　方法质量控制

2.2.1 　银元素相对原子质量数的选择及检出限对于ICP‐MS 测定同位素相对原子质量数的选择，在避开同质异位素和氧化还原物等多原子离子干扰的前提下，应尽可能选择高丰度的同位素。在优化仪器工作参数后，银元素检出限的测定是通过连续10 次测量空白溶液，然后以3 倍空白溶液的标准偏差除以线性相关

系数(标准曲线的斜率)作为仪器的检出限。本方法确定银的检出限为0.98 μg · kg - 1 ，标准曲线相关系数为0.999 9 。

2.2.2 　方法的准确度试验

为了评价方法的准确度，血清和组织器官样品需做加标回收试验。具体过程是将每个样品等量分成2 份，1 份样品的处理同前所述，另1 份在此基础上加入含有被测银元素的标准样品，然后两份样品在相同条件下处理并测定。由表6可以看出，银元素回收率为98% ～ 107% ，说明此方法对于血清和组织器官中微量银元素的测定准确可靠。

2.2.3 　方法的精密度试验

为了验证方法的精密度，将同一样品平均分为6 份，进行重复实验，评估分析方法的精密度。相对标准偏差(RSD)是6 次测量结果的标准偏差与算术平均值的比值，反映了该方法检测同一样品的重现性 。本方法检测银元素的RSD

介于2.0% ～ 4.3% 之间，方法精密度良好。

2.2.4 　样品的稳定性试验

将6 份经过测定之后的样品消解溶液置于冰箱4 ℃ 保存，分别在其后1 ，4 ，7 天采用相同方法进行检测并对结果统计分析，考察样品溶液的稳定性。结果显示第1 ，4 和7天的测定值与首次测定值相一致，差异无统计学意义，表明银元素在一周内的稳定性良好。

2.3 　样品测定结果

根据标准曲线，获得如下公式，根据仪器读值ρ 计算出样品中银的含量

　　式中：ω(Ag) ：样品中银的含量，mg· kg-1 ;

　　ρ ：测试溶液中银的质量浓度，μg · L-1 ;

　　V ：样品定容体积，mL ;

　　f ：样品稀释倍数;

　　m ：样品取样量，g 。

通过ICP‐MS 测定各时间点样品(n = 5) ，发现植入β‐磷酸三钙的空白对照组体内均未检出银离子，可能与实验动物日常饮食未摄入银或者体内银含量太低达不到检出限有关。植入载银β‐磷酸三钙的实验组在各个时期均能检测出银离子含量，结果见表7 。检测结果表明配制标准曲线时以稀硝酸作为基体液，而非以空白对照样品消解液为基体液，是可行的，简便易行。检测结果显示银在体内分布以肝脏最多，其次为脾脏，心脏内最少，本工作结果可为今后研究银系抗菌内植物方面提供重要参考，其组织器官产生毒性反应的剂量将在另文讨论。

结　论

在前人研究的基础上建立了HNO3‐H2 O2 微波消解‐ICP‐MS 测定动物血清和组织器官中微量银元素的分析方法，该法操作简便快捷、结果准确可靠、灵敏度高、适用性强，可满足不同类型医学生物样品中微量银元素的测定，尤其适合大批量生物样本检测。机体摄入银离子后，其浓度在全身各个组织器官的分布均不相同，主要以肝脏为靶器官，而银在内植物周围局部组织分布相对均匀，且缓释持久稳定，为临床骨感染的预防和治疗提供了一种有效手段。