化妆品中7种常见抗生素的超快速液相色谱测定法

化妆品中7种常见抗生素的超快速液相色谱测定法

　　抗生素属于处方药，我国《化妆品卫生规范》[1(] 以下简称《规范》)规定此类物质为禁用成分，然而市场抽检往往会有检出[2-4]。国内对化妆品中7 种常见抗生素(盐酸米诺环素、盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素、氯霉素及甲硝唑)的检测方法多采用高效液相色谱法(HPLC)[5-7]，2007 版《规范》也是采用HPLC 法。超快速液相色谱(UFLC)是近2 年来新发展的液相色谱技术，代表了液相色谱发展方向。本研究建立了UFLC 法同时测定化妆品中7 种常见抗生素的方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　LC7000(海能仪器股份有限公司);盐酸四环素(97.5%)、盐酸金霉素(99.0%)、氯霉素(98.5%)及甲硝唑(99.4%)标准品，盐酸米诺环素(85.1%)、盐酸土霉素(88.2%)、盐酸多西环素(86.0%);甲醇、乙腈和甲酸均为色谱纯;超纯水。

　　1.2 方法

　　1.2.1 色谱条件色谱柱为 C18 柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流动相A 为甲醇-乙腈(体积比为1∶2)，流动相B 为1%甲酸水溶液，采用梯度洗脱，初始时流动相A 体积分数为10%，至3.5 min 线性增长至30%，然后保持1.5 min，5.0 min后恢复初始流动相，平衡1.5 min 结束，流量为0.2 ml/min;检测波长为268 nm;进样量为2 μl。

　　1.2.2 标准溶液的配制单标储备溶液：准确称取各种标准物质约10 mg 分别至10.0 ml 容量瓶中，用1 ml 甲醇及1 ml 1%甲酸水溶液溶解，甲醇定容至刻度，各单标浓度约为1 mg/ml。校准曲线：根据所需标样浓度，移取适量各单标中间液于10.0 ml 容量瓶中，流动相定容，标准系列为1、2、5、10、50 mg/L，临用现配。

　　以标准系列质量(ng)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制校准曲线。

　　1.2.3 样品前处理提取方法借鉴《规范》[1]，但考虑到氯离子对仪器有一定的腐蚀性，用甲酸替代盐酸。即：称取化妆品样品1.00 g 于10 ml 具塞比色管中，加入甲醇和甲酸(1%)等体积混合溶液至刻度，摇匀，超声提取20 min，必要时于离心机上以1610 离心5 min，经0.22 μm 滤膜过滤得到待测液，在设定色谱条件下上机分析。

　　2 结果与讨论

　　2.1 流动相及洗脱条件的选择

　　流动相优化：流动相中的有机相选择借鉴了《规范》[1]。四环素类化合物属于两性化合物，从色谱理论上讲，流动相可以是酸性或碱性，但由于盐酸四环素和盐酸土霉素在碱性条件下易破坏失效[8]，所以选择酸性流动相。随着改变流动相中甲酸含量分别为0.1%，0.2%，0.5%和1.0%，发现甲硝唑的保留时间逐步变化，当甲酸含量为1.0%时，保留时间逐步达到稳定，方法的重现性和耐用性最佳。由于7 种化合物的极性差别大，所以宜采用梯度洗脱方式。另外，试验显示采用梯度洗脱比等度洗脱更能提高目标物质的检测灵敏度。图1 为7 种抗生素的标准色谱图，各化合物在5 min 内得到分离，其保留时间见表1。

　　2.2 方法的线性范围和检出限

　　在设定色谱条件下，标准系列溶液的绝对质量与色谱峰面积呈线性相关。检测下限以噪音的3 倍计算。7 种抗生素的回归方程、相关系数、线性范围及仪器检出限见表l。

　　2.3 准确度与精密度

　　向不含待测7 种物质的祛痘除螨类样品中分别加入高低两种浓度的混合标准溶液，使加标量分别为5 和20 mg/kg，混匀过夜，依照前述样品处理方法提取测定，每个添加水平平行测定6份。7 种抗生素的平均回收率为82.5%~105.0%，RSD 为0.4%~4.8%(n=6)。7 种抗生素的精密度及准确度结果见表2。

　　2.4 实际样品测定

　　对11 份市售祛痘除螨类化妆品的分析表明，2 份检出氯霉素，检出质量分数分别为0.37% 和0.19%;1 份检出甲硝唑，质量分数为1.02%;盐酸米诺环素、盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素未检出。图2 为同时检出甲硝唑和氯霉素的某阳性样品色谱图，峰2 保留时间为1.35 min，为杂质出峰，不影响对峰1 甲硝唑的定性。

　　3 小结

　　本研究建立了化妆品中7 种常见抗生素的UFLC 检测方法，与已报道的HPLC 方法比较，该方法检验速度更快，检出限更低，废液排放少，其他方法学参数都能达到要求。