高效液相色谱-蒸发光散射检测法，同时测定四君子丸中的5 种有效成分

高效液相色谱-蒸发光散射检测法，同时测定四君子丸中的5 种有效成分

　　四君子丸为四君子汤的现代剂型，由党参、白术、茯苓、炙甘草组成，被《中华人民共和国药典》( 2005 版) 收载[1]。现代药理学研究证明，四君子汤可增强机体的抵抗力，调节机体各方面的功能，对垂体、心血管功能、消化道运动功能和免疫功能有明显的改善作用[2]。四君子丸含有党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ等主要活性成分[3 - 7]。对于党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ的定量分析方法，已有的文献报道均是对其中的一种或两种成分进行测定[8 - 14]，尚未见对上述5 种活性成分同时测定的报道。按照药典[1]的规定，对四君子丸的鉴定仅依靠薄层色谱法进行，结果比较粗放。本文对四君子丸中的上述5种活性成分同时进行了含量测定，可为四君子丸的全面质量控制提供实验依据。

　　1 实验部分

　　1. 1 仪器与试药

　　LC7000高效液相色谱仪(海能仪器) ，包括LC7011输液泵，LC7070蒸发光散射检测器; HanonClatity色谱工作站。HIQ SIL C18V 色谱柱( 250 mm× 4. 6 mm，5 μm) 。甲醇( 色谱纯) ，二次蒸馏水( 自制) ，冰醋酸( 分析纯) ; 党参炔苷 、苍术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ 、茯苓酸 和甘草酸铵 对照品; 党参、白术、茯苓、甘草均购于济南漱玉平民药店; 用于方法优化的四君子丸样品为自制，每丸平均质量为3. 0 g，符合中国药典对丸剂的各项规定要求。测定的四君子丸实际样品分别为5 个药品生产厂家的产品。

　　1. 2 对照品溶液的制备

　　分别精密称取党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ对照品适量，分别配制质量浓度为6. 03，3. 78，12. 24，3. 62，7. 80 g /L 的储备液。将上述5 种储备液各取500 μL 混合、摇匀，即得含党参炔苷1. 21 g /L、茯苓酸0. 76 g /L、甘草酸2. 45 g /L、苍术内酯Ⅲ 0. 72 g /L 和白术内酯Ⅰ 1. 56g /L 的混合对照品储备液。

　　1. 3 供试品溶液的制备

　　取丸剂研碎，并称取1. 00 g，加入乙醇15 mL，超声提取30 min，过滤。滤渣再重复提取2 次。合并提取液并浓缩，转移至10 mL 容量瓶中，用乙醇定容，摇匀; 取其中1 mL 于16 000 r /min 速率下离心10 min，上清液作为供试品溶液。

　　1. 4 色谱条件

　　色谱柱: HIQ SIL C18V 柱( 250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ; 流动相: 0. 5%冰乙酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B; 梯度洗脱程序: 0 - 40 min，80%A -20%A; 流速: 1. 0 mL /min; 进样量: 10 μL; 漂移管温度: 55 ℃; 喷雾器加热级别: 60%; 载气: 氮气，压力0. 2 MPa; 信号增益值: 50。

　　2 结果与讨论

　　2. 1 色谱条件的优化

　　2. 1. 1 检测器的选择

　　由于欲测定的样品中苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ的紫外吸收比较弱，且苍术内酯Ⅲ含量较低，为了提高检测的灵敏度，本文采用蒸发光散射检测器检测。以信噪比( S /N) 为指标，分别对蒸发光散射检测器的漂移管温度和载气压力进行了优化。结果在漂移管温度55 ℃、载气压力0. 2 MPa ( 30 psi) 时，可以获得最佳的信噪比。

　　2. 1. 2 流动相及洗脱程序的优化

　　本文的前期研究工作发现，四君子丸提取物的组成复杂，干扰成分多，欲测定的各组分的保留因子范围较宽，不适宜等度洗脱，因此选择了梯度洗脱。流动相分别选择甲醇-水( 含冰乙酸) 、甲醇-水( 含磷酸) 体系进行梯度洗脱试验，相对来说，前者比后者的分离度好，灵敏度高。应用不同梯度陡度( T) 的甲醇-水( 含冰乙酸) 体系进行试验的结果表明，在0

　　- 40 min，甲醇的体积比从20% 升至80%，即T =0. 015 时，可在40 min 内使所测定的组分分离。

　　为了考察冰乙酸的浓度对测定组分色谱行为的影响，在T = 0. 015 条件下，分别用0 ～ 1. 5% ( 体积分数) 的冰乙酸进行梯度洗脱。结果表明，当以甲醇和0. 5%冰乙酸水溶液为流动相时，各色谱峰的对称性较好，峰形尖锐，且各峰与相邻峰的分离度均大于1. 2，所以选择了1. 4 节所述的流动相条件。

　　2. 2 系统的适用性

　　取供试品溶液10 μL 进样，记录色谱图，党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ的保留时间分别为7. 1，11. 6，17. 2，23. 4 和26. 5 min，各峰与相邻峰的分离度均大于1. 2。供试品及对照品的色谱图见图1。

　　2. 3 方法学考察

　　2. 3. 1 线性方程、检出限及精密度

　　将对照品储备液稀释成不同的浓度，按前述色谱条件测定峰面积，分别以各分析物色谱峰面积( Y) 的对数值为纵坐标、质量浓度( X，g /L) 的对数值为横坐标绘制标准曲线，得到党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ的线性方程、相关系数和线性范围( 见表1) 。取混合对照品储备液不断稀释后进样分析，以3 倍信噪比确定检出限，结果

　　见表1。

　　取一定浓度的混合对照品溶液，分别进行峰面积和保留时间的日内及日间测定的精密度( 以相对标准偏差( RSD) 计) 考察。在同一天连续进样6次，计算日内精密度; 每份样品连续测定6 d，计算日间精密度; 结果亦列于表1。表1 的结果表明，5种分析物峰面积和保留时间的RSD 均较小，表明方法的重复性良好。

　　按1. 3 节的方法平行制备6 份供试品，测定并计算5 种有效成分的含量，党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ含量的RSD 分别为2. 25%，1. 87%，1. 58%，1. 65%和1. 72%，表明方法的重现性良好。

　　2. 3. 2 供试品溶液的稳定性

　　取新制备的同一份供试品溶液，分别在室温下放置0，1，2，4，8，12，24 h 后进样分析。党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ峰面积的RSD 分别为1. 25%，1. 67%，1. 19%，1. 43%和1. 38%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

　　2. 3. 3 加标回收率

　　精密称取自制的丸剂12 份，分为4 组，每组3份。每组样品中分别精密加入混合对照品储备液0，20，50，100 μL，按所建立的方法进行供试品溶液的制备和测定，计算党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ的含量，计算各组分的回收率，结果见表2。

　　表2 结果表明，所有组分的加标回收率在97. 13% ～ 100. 25% 范围内，RSD 均小于2. 44%，说明本方法准确可靠。

　　2. 4 样品的测定

　　分别取5 个厂家生产的四君子丸，按1. 3 节的方法操作，取供试品溶液10 μL 进样分析，并计算丸剂中5 种成分的含量，结果见表3。

　　3 结语

　　本文所建立的反相高效液相色谱-蒸发光散射检测梯度洗脱方法能够准确、灵敏地同时测定四君子丸中党参炔苷、茯苓酸、甘草酸、苍术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ的含量，测定结果可靠，为四君子丸的质量控制提供了简单、有效的检测手段。